La ELISA es una técnica de laboratorio que sirve para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos en una muestra. Este método es altamente sensible y específico lo que lo convierte en una herramienta estupenda en diagnósticos médicos, investigación biomédica y dentro del control de calidad en la industria farmacéutica y alimentaria.
Esta técnica se utiliza de forma rutinaria para detectar enfermedades infecciosas como el VIH, la hepatitis y el COVID-19. También es clave en endocrinología para medir niveles hormonales, para la detección de alérgenos y en estudios farmacológicos para el desarrollo de nuevos fármacos.
La ELISA permite analizar múltiples muestras de manera simultánea, esto es de gran ayuda porque ayuda en ahorrar tiempo y recursos, y debido a su facilidad de uso y su buena precisión lo hace una opción muy confiable para laboratorios de todo el mundo.
Orígenes de la ELISA
La ELISA fue desarrollado en la década de 1970 por los inmunólogos suecos Peter Perlmann y Eva Engvall. Su invención surgió de la necesidad de crear un método más práctico y eficiente para detectar y cuantificar proteínas, anticuerpos y antígenos en muestras biológicas.
Antes del ELISA los ensayos de radioinmunoensayo (RIA) eran la técnica estándar para medir antígenos. Los RIA, aunque eran efectivos, utilizaban isótopos radiactivos lo que presentaba riesgos para la salud y problemas logísticos en su manejo y eliminación.
Para ello se creó la ELISA, se buscaba una técnica que reemplazara la radiactividad con enzimas proporcionando una solución más segura y adaptable.
Hoy en día la ELISA es utilizado en laboratorios de todo el mundo, desde hospitales hasta centros de investigación para detectar enfermedades infecciosas, medir niveles hormonales y estudiar diversas interacciones biomoleculares. Su creación no solo fue una solución práctica, sino que también transformó la manera en que los laboratorios realizan pruebas diagnósticas haciéndolas más accesibles, rápidas y seguras.
Ensayo ELISA
¿Cómo funciona el ensayo ELISA?
El ensayo ELISA es una técnica que se basa en la interacción altamente específica entre anticuerpos y antígenos. El objetivo es inmovilizar el antígeno o anticuerpo de interés en una superficie sólida como una placa de microtitulación y usar una enzima para generar una señal detectable (generalmente un cambio de color) cuando se produce la interacción deseada. Sabiendo esto, podemos decir que la ELISA se basa en dos “principios”:
- La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo: La clave del ensayo es la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente a su antígeno diana.
- El Enlace enzimático: La enzima conjugada con el anticuerpo secundario o el antígeno genera una señal medible, que generalmente es un cambio de color cuando el sustrato enzimático es añadido. Esta señal es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra.
Pasos de un ensayo ELISA
Realizar el ensayo ELISA resulta bastante simple, aunque puede variar un poco dependiendo del tipo de ELISA especifica que realicemos, la mayoría de estos siguen el siguiente procedimiento:
- Fijación de antígeno o anticuerpo: El antígeno (o anticuerpo) de interés se inmoviliza en los pocillos de una placa de microtitulación. Esta fijación es clave ya que permite que el anticuerpo o antígeno interactúe directamente con las muestras que se aplicarán más tarde.
- Adición del anticuerpo específico: Se añade un anticuerpo primario que reconoce específicamente el antígeno en cuestión.
- Conjugación con enzima: Se introduce un anticuerpo secundario que está conjugado con una enzima. Este anticuerpo se une al anticuerpo primario y la enzima es la responsable de la señal que permitirá cuantificar el resultado.
- Adición del sustrato enzimático: El sustrato enzimático reacciona con la enzima conjugada generando un cambio de color que es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra.
- Lectura de resultados: El cambio de color es medido usando un lector de placas ELISA que cuantifica la intensidad del color generado. La concentración del antígeno o anticuerpo en la muestra se calcula en función de la intensidad de esta señal de color.
Para mejorar la precisión de los resultados, es fundamental optimizar cada uno de estos pasos como por ejemplo asegurando que el sustrato enzimático esté fresco o que los anticuerpos sean los adecuados para la molécula de interés.
También hay que mencionar que siempre se tiene que realizar controles positivos y negativos en cada ensayo para validar los resultados.
Tipos de ensayo ELISA
Existen varios tipos de ensayos ELISA, cuatro son los más comunes, cada uno con características que lo hacen más adecuado para ciertos tipos de análisis.
- ELISA Directo: Es el explicado antes, en este tipo de ensayo el antígeno se inmoviliza en la placa y se añade un anticuerpo primario directamente conjugado con una enzima. Es el método más rápido y sencillo ya que solo implica un paso de unión del anticuerpo.
- ELISA Indirecto: Aquí un anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno en la placa seguido por un anticuerpo secundario conjugado con una enzima. Este método mejora la sensibilidad en comparación con el ELISA directo ya que permite la amplificación de la señal a través del anticuerpo secundario.
- ELISA en Sándwich: Es el tipo de ELISA más común y eficiente. Utiliza dos anticuerpos: uno para captar el antígeno y otro para detectarlo. El antígeno queda «atrapado» entre estos dos anticuerpos, de ahí su nombre. Este formato ofrece alta especificidad ya que dos anticuerpos distintos deben reconocer el mismo antígeno.
- ELISA Competitivo: Este formato es útil para detectar pequeñas moléculas o antígenos en bajas concentraciones. El antígeno de la muestra compite con un antígeno marcado para unirse al anticuerpo. A menor señal mayor es la concentración de antígeno en la muestra. Resulta particularmente útil en el análisis de toxinas o fármacos.
Tipos de ensayo ELISA
Cada tipo de ELISA tiene ventajas y limitaciones, por lo que la elección del tipo de ensayo dependerá del análisis que se desee realizar y de las características del antígeno o anticuerpo que se esté investigando.
Kit de reactivos para ELISA
Aunque el procedimiento para realiza una ELISA es sencillo este necesita de varios reactivos, habitualmente, las ELISA se compran en un kit.
Un kit de ELISA típico contiene una serie de reactivos esenciales para garantizar que el ensayo se realice de manera eficiente y precisa. Los reactivos que suelen contener los kits para ELISA son:
- Placa de microtitulación: Estas placas contienen pocillos donde se inmoviliza el antígeno o anticuerpo.
- Anticuerpos primarios: Son específicos para el antígeno de interés para el que se compra.
- Anticuerpos secundarios: Estos anticuerpos están conjugados con una enzima que será responsable de producir la señal detectable en el ensayo.
- Sustrato enzimático: El sustrato se añade para que la enzima genere un cambio de color lo que permite la detección y cuantificación de la reacción.
- Soluciones de lavado: Después de cada paso de incubación se utilizan soluciones de lavado para eliminar cualquier material no unido, lo que ayuda a minimizar el ruido de fondo y mejora la precisión del ensayo.
Medidas de Seguridad al Realizar un Ensayo ELISA
Aunque el ensayo ELISA es una técnica común y segura, en los laboratorios siempre hay peligro y el manejo de ciertos reactivos puede conllevar riesgos si no se siguen las medidas de seguridad adecuadas. Siempre tener en cuenta lo siguiente:
- Utilizar equipo de protección personal (EPP): Siempre utilizar guantes de nitrilo o látex, bata de laboratorio y protección ocular (gafas de seguridad) para evitar el contacto directo con reactivos, muestras biológicas o posibles sustancias tóxicas.
- Manipulación de muestras biológicas: Las muestras utilizadas en ELISA como sueros o fluidos corporales pueden contener patógenos peligrosos (virus, bacterias, etc.). Es esencial tratarlas como potencialmente infecciosas, y para ello siempre desechar las muestras biológicas en contenedores de residuos biológicos siguiendo los protocolos de bioseguridad.
- Reactivos con riesgo citotóxico o irritante: Algunos reactivos empleados en la ELISA como algunos sustratos enzimáticos (por ejemplo TMB o tetrametilbenzidina) o soluciones de parada (como el ácido sulfúrico diluido) pueden ser tóxicos o irritantes al contacto. Importante siempre trabajar en una campana extractora cuando se manejan volúmenes de estos reactivos.
- Desinfectar el área de trabajo: Después de completar el ensayo es necesario desinfectar la superficie de trabajo y los instrumentos utilizados con una solución de etanol o hipoclorito de sodio para evitar la contaminación cruzada y garantizar un ambiente seguro para futuras pruebas.
- Eliminación de residuos: Los residuos del ensayo como las puntas de pipeta, placas ELISA usadas o cualquier material que haya estado en contacto con las muestras o reactivos deben desecharse en contenedores apropiados para residuos biológicos o químicos siguiendo las normativas locales.
Seguir estas medidas no solo garantiza la seguridad del personal sino que también asegura la precisión y confiabilidad de los resultados obtenidos en el ensayo.